Plasma membrane proteins are modulated after vaccinia virus-infection

HFFF-TERTs or HeLa cells were mock-treated or infected with VACV at MOI 5 in DMEM supplemented with 2% FCS, 1% P/S. Cells were harvested at 15-18 hpi using accutase solution following the manufacturer’s instructions (Sigma-Aldrich). Validation of PM protein expression was performed with ~2x10^5 cells /sample, stained with Zombie NIR Fixable Viability Kit (Biolegend) in combination with the following antibodies: MHC-I (W6/32, kindly provided by Dr L. Boyle), MICA (2C10, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), EPHB4 (rea923, Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany), FAS(CD95) (DX2, Miltenyi Biotech), EGFR (528, Santa Cruz), HLA-B/C (4E, kindly provided by Dr L. Boyle), HLA-C/E (DT9, kindly provided by Dr L. Boyle), ULBP3 (166510, R&D systems), B7-H6 (875001, R&D systems, Minneapolis, U.S.A), ULBP-2/5/6 (65903, R&D systems), Plexin-B1 (rea728, Miltenyi Biotech), MICB (236511, R&D systems), TNFSRF10D (trail-R4) (104918, R&D systems), CD155 (SKII.4, Santa Cruz), isotype mouse Igg2b (Santa Cruz), isotype mouse IgG2a (Santa Cruz), isotype mouse IgG1 (Santa Cruz). Samples stained with unconjugated primary antibodies were subsequently probed with PE-conjugated Goat anti-mouse IgG (BioLegend). Cells were fixed using Fixation/Permeabilization Solution Kit according to the manufacturer’s instructions (BD Biosciences). Samples were analysed by flow cytometry using an Invitrogen Attune NxT cytometer and FlowJo software.

本实验以HFFF-TERTs细胞与HeLa细胞为研究对象，分别设置空白模拟处理对照组，以及以感染复数（MOI, Multiplicity of Infection）5的痘苗病毒（VACV, Vaccinia Virus）感染组，细胞培养于添加2%胎牛血清（FCS, Fetal Calf Serum）与1%青霉素-链霉素（P/S, Penicillin-Streptomycin）的达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM, Dulbecco's Modified Eagle Medium）中。于感染后15-18小时（hpi, hours post infection）收集细胞，使用脱细胞酶（accutase）溶液按照生产商说明书（Sigma-Aldrich）进行操作。针对细胞膜（PM, Plasma Membrane）蛋白表达的验证实验以每份样本约2×10^5个细胞为实验体系，采用Zombie NIR固定活细胞染色试剂盒（Biolegend）结合下述抗体进行染色：主要组织相容性复合体I型（MHC-I）（克隆号W6/32，由L. Boyle博士惠赠）、MICA蛋白（克隆号2C10，圣克鲁斯生物技术公司，美国加利福尼亚州圣克鲁斯）、EPHB4蛋白（克隆号rea923，美天旎生物技术公司，德国贝尔吉施格拉德巴赫）、FAS（CD95）蛋白（克隆号DX2，美天旎生物技术公司）、表皮生长因子受体（EGFR, Epidermal Growth Factor Receptor）（克隆号528，圣克鲁斯生物技术公司）、人类白细胞抗原B/C型（HLA-B/C）（克隆号4E，由L. Boyle博士惠赠）、人类白细胞抗原C/E型（HLA-C/E）（克隆号DT9，由L. Boyle博士惠赠）、ULBP3蛋白（货号166510，R&D系统公司）、B7-H6蛋白（货号875001，R&D系统公司，美国明尼阿波利斯）、ULBP-2/5/6蛋白（货号65903，R&D系统公司）、Plexin-B1蛋白（克隆号rea728，美天旎生物技术公司）、MICB蛋白（货号236511，R&D系统公司）、TNF超家族受体10D（TNFSRF10D，即TRAIL-R4）（货号104918，R&D系统公司）、CD155蛋白（克隆号SKII.4，圣克鲁斯生物技术公司）、小鼠IgG2b同型对照（圣克鲁斯生物技术公司）、小鼠IgG2a同型对照（圣克鲁斯生物技术公司）、小鼠IgG1同型对照（圣克鲁斯生物技术公司）。针对未标记一抗的染色样本，后续使用藻红蛋白（PE, Phycoerythrin）标记的山羊抗小鼠IgG二抗（Biolegend）进行孵育。使用固定破膜试剂盒按照生产商说明书（BD生物科学公司）对细胞进行固定处理。采用Invitrogen Attune NxT流式细胞仪及FlowJo软件对样本进行流式细胞术分析。