Ocena immunohistochemiczna wybranych białek w nasieniaku jądra w porównaniu do tkanki kontrolnej

Celem działania naukowego była ocena udziału wybranych białek w tkance nowotworów złośliwych jąder – nasieniakach, w odniesieniu do tkanki kontrolnej.Nasieniaki jąder stanowią bardzo istotny problem kliniczny, szczególnie w grupie pacjentów między 30 a 40 rokiem życia. W tej grupie chorych są najczęściej występującym nowotworem złośliwym. Z uwagi na podstępny, często bezobjawowy przebieg guz ten może być rozpoznany w późnym stadium, z obecnymi przerzutami odległymi. Wzrost zachorowalności na nowotwory jądra zaobserwowano w ostatnich dziesięcioleciach głównie w krajach uprzemysłowionych. Złotym standardem w leczeniu guzów jąder jest operacyjne usunięcie zmienionego nowotworowo narządu.Ocenie poddano wybrane białka, na temat których nie odnaleziono wiele doniesień w literaturze naukowej, biorąc pod uwagę ich udział w nowotworach złośliwych jądra. Analizie poddano białko wiążące kalcyklinę - CacyBP/SIP (ang. calcyclin binding protein/Siah-1 interacting protein) oraz jego możliwy wpływ na działanie wybranych kinaz białkowych. Ocena nowej funkcji białka CacyBP/SIP, jako enzymu defosforylującego jest niepoznanym dotąd zagadnieniem. Stąd celem przeprowadzonego badania była analiza CacyBP/SIP, jako fosfatazy dla grupy kinaz białkowych aktywowanych mitogenami - MAPK (ang. mitogen-activated protein kinases) w zarodkowym nowotworze złośliwym jądra – nasieniaku, w porównaniu z tkanką nienowotworową. Ocenie poddane zostały dwa rodzaje MAPK: kinazy regulowane sygnałem zewnątrzkomórkowym - ERK1/2 (ang. extracellular signal-regulated kinase) oraz kinaza p38α.  Grupę badaną stanowiło 30 pacjentów z histopatologicznym rozpoznaniem nasieniaka, leczonych operacyjnie w Klinice Urologii Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku. Pierwotnie miała być to grupa 60 pacjentów. Z uwagi na rygorystyczne kryteria doboru pacjentów, z całej grupy pacjentów do badania ostatecznie zakwalifikowano połowę. Wykluczono pacjentów, u których w badaniu histopatologicznym stwierdzono miejscowe zaawansowanie choroby, a także chorych z rozpoznanymi przerzutami. Materiał kontrolny stanowiły fragmenty tego samego jądra, pobrane z przeciwległego w stosunku do guza, bieguna narządu. Były to fragmenty, makroskopowo i histopatologicznie niewykazujące cech rozrostu nowotworowego.W pobranym materiale ze zmiany nowotworowej ocenie immunohistochemicznej poddano białka: CacyBP/SIP, p-ERK1/2 oraz p38. Ocena morfometryczna została przeprowadzona przy użyciu komputera klasy PC zaopatrzonego w oprogramowanie do komputerowej analizy obrazu, NIS-Elements Advanced Research firmy Nikon. Komputerowy program morfometrycznej analizy obrazu pozwolił ocenić intensywność reakcji immunohistochemicznych. Za pomocą techniki RT-qPCR została dokonana ocena ekspresji genów kodujących Cacybp, Mapk3, Mapk1 i Mapk14.Silną immunoreaktywność białka CacyBP/SIP stwierdzono w nienowotworowej tkance jądra, głównie w cytoplazmie komórek nabłonka kanalików nasiennych jąder. Immunoreaktywność CacyBP/SIP we wszystkich nasieniakach okazała się być bardzo niska. Jądrową lub cytoplazmatyczną lokalizację białka CacyBP/SIP zaobserwowano tylko w pojedynczych komórkach nowotworowych. Analiza immunohistochemiczna wykazała umiarkowaną reaktywność ERK 1/2 zarówno w cytoplazmie, jak i jądrach komórek nabłonka kanalików nasiennych w tkance kontrolnej, podczas gdy w nasieniakach reaktywne były tylko jądra komórkowe. Podobnie immunoreaktywność białka p38 w nasieniakach była znacząco osłabiona w porównaniu z tkankami nienowotworowymi. Analiza QRT-PCR wykazała istotny spadek ekspresji genów CacyBP/SIP, ERK 1/2 i p38 w nasieniaku w porównaniu z tkanką kontrolną. Wyniki QRT-PCR potwierdziły rezultaty analizy immunohistochemicznej.Przeprowadzona analiza białek CacyBP/SIP, ERK1/2 oraz p38 w nasieniakach jąder dostarczyła nowatorskich danych na temat ich udział w tym procesie karcynogenetycznym. Uzyskane wyniki nie pozostawiają żadnych wątpliwości odnośnie znaczącego udziału powyższych białek w patomechanizmie powstawania i rozwoju nasieniaków jąder. Przeprowadzone badanie może rzucić nowe światło na mechanizmy leżące u podstaw rozwoju nowotworu, migracji komórek indukowanych białkiem CacyBP/SIP, a tym samym na nowe spojrzenie diagnostyczno-terapeutyczne. Ponadto, mogą mieć nieocenioną wartość kliniczną z uwagi na możliwość wykorzystania oznaczanych parametrów, jako potencjalnych biomarkerów wczesnego wykrycia, a także, jako potencjalnego celu farmakoterapii. Obecnie wyniki te poddawane są wnikliwej analizie mającej na celu ich wzajemne powiązanie oraz ocenę oddziaływań badanych białek względem siebie. W przygotowaniu jest również manuskrypt opisujący uzyskane rezultaty.

The aim of the scientific work was to evaluate the involvement of selected proteins in the tissue of malignant testicular tumors—testicular germ cell tumors (TGCTs)—relative to control tissue.

Testicular germ cell tumors (TGCTs) constitute a very significant clinical problem, especially among patients aged 30 to 40 years. In this group of patients, they are the most common malignant tumor. Due to their insidious, often asymptomatic course, these tumors may be diagnosed at an advanced stage with distant metastases present. An increase in the incidence of testicular tumors has been observed in recent decades, mainly in industrialized countries. The gold standard in the treatment of testicular tumors is the surgical removal of the tumor-affected organ.

Selected proteins, about which few reports exist in the scientific literature regarding their involvement in malignant testicular tumors, were subjected to evaluation. The calcyclin-binding protein—CacyBP/SIP (calcyclin binding protein/Siah-1 interacting protein)—and its potential impact on the activity of selected protein kinases were analyzed. Evaluating the novel function of the CacyBP/SIP protein as a dephosphorylating enzyme is a hitherto unrecognized issue. Hence, the aim of the study was to analyze CacyBP/SIP as a phosphatase for the group of mitogen-activated protein kinases (MAPK) in malignant testicular germ cell tumors (TGCTs) compared to non-tumor tissue. Two types of MAPK were evaluated: extracellular signal-regulated kinases—ERK1/2 (extracellular signal-regulated kinase)—and p38α kinase.

The study group consisted of 30 patients with a histopathological diagnosis of testicular germ cell tumor who underwent surgical treatment at the Department of Urology of the Medical University of Bialystok. Initially, this group was to include 60 patients. Due to strict patient selection criteria, only half of the total patient group was finally qualified for the study. Patients with histopathologically confirmed local disease progression and those with diagnosed metastases were excluded.

The control material consisted of fragments of the same testicle taken from the pole of the organ opposite to the tumor. These fragments showed no macroscopic or histopathological signs of tumor growth.

In the collected material from the tumor lesion, the proteins CacyBP/SIP, p-ERK1/2, and p38 were subjected to immunohistochemical evaluation. Morphometric assessment was performed using a PC-class computer equipped with image analysis software—NIS-Elements Advanced Research by Nikon. The computer program for morphometric image analysis allowed the intensity of immunohistochemical reactions to be evaluated.

Using RT-qPCR technology, the expression of genes encoding Cacybp, Mapk3, Mapk1, and Mapk14 was evaluated.

Strong immunoreactivity of the CacyBP/SIP protein was found in non-tumor testicular tissue, mainly in the cytoplasm of the epithelial cells of the testicular seminiferous tubules. The immunoreactivity of CacyBP/SIP in all testicular germ cell tumors was very low. Nuclear or cytoplasmic localization of the CacyBP/SIP protein was observed only in individual tumor cells.

Immunohistochemical analysis showed moderate ERK1/2 reactivity in both the cytoplasm and nuclei of the epithelial cells of the seminiferous tubules in control tissue, whereas in testicular germ cell tumors, only the cell nuclei were reactive. Similarly, the immunoreactivity of the p38 protein in testicular germ cell tumors was significantly reduced compared to non-tumor tissues.

QRT-PCR analysis revealed a significant decrease in the expression of the CacyBP/SIP, ERK1/2, and p38 genes in testicular germ cell tumors compared to control tissue. The QRT-PCR results confirmed the findings of the immunohistochemical analysis.

The analysis of the CacyBP/SIP, ERK1/2, and p38 proteins in testicular germ cell tumors provided innovative data on their involvement in this carcinogenetic process. The obtained results leave no doubt regarding the significant involvement of these proteins in the pathogenesis of testicular germ cell tumor development and progression.

The study may shed new light on the mechanisms underlying tumor development and cell migration induced by the CacyBP/SIP protein, thereby opening new diagnostic and therapeutic perspectives.

Furthermore, these findings may have immeasurable clinical value due to the possibility of using the measured parameters as potential biomarkers for early detection and as potential targets for pharmacotherapy.

Currently, these results are undergoing in-depth analysis aimed at establishing their mutual relationships and evaluating the interactions between the studied proteins. A manuscript describing the obtained results is also in preparation.