hodowla keratynocytów wyprowadzonych ze środkowych fragmentów mieszka włosowego (1)

Celem badania było uzyskanie keratynocytów wyprowadzonych ze środkowych fragmentów mieszka włosowego. W eksperymencie użyto mieszków włosowych, izolowanych ze skóry czterotygodniowych samic szczurów szczepu Wistar Albino Glaxo. Po 72 h hodowli izolowanych mieszków włosowych komórki tworzące kolonie wokoło macierzystych mieszków odklejano od plastiku za pomocą roztworu trypsyny z dodatkiem EDTA (Gibco). Po dodaniu 1,5 ml trypsyny hodowle inkubowano 5 minut w temperaturze 37° C, a następnie do butelek dodawano 1,5 ml roztworu sojowego inhibitora trypsyny (Sigma) w PBS, w stężeniu 8 mg/ml Zawiesina była kilkakrotnie energicznie pipetowana, aby rozbić agregaty komórek, a następnie filtrowana przez nylonowy filtr o średnicy oczek 20 μm (Millipore, Billerica, MA, USA) w celu usunięcia pozostałości włosa i agregatów komórek. Komórki płukano roztworem PBS bez jonów wapnia i magnezu, i wysiewane do płytek dwunastostudzienkowych (Costar) w ilości 100 000 komórek na oczko w standardowej pożywce do hodowli keratynocytów. Komórki dodatkowo suplementowano EGF (20 ng/ml pożywki) (PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA). Hodowle fotografowano w mikroskopie świetlnym odwróconym z kontrastem fazowym. Na zdjęciach hodowle keratynocytów wyprowadzonych ze środkowych fragmentów mieszka włosowego i stymulowanych EGF w stężeniu 20 ng/ml; (a) keratynocyty kontrolne, (b), (c) i (d) keratynocyty stymulowane odpowiednio przez 12, 24 i 48 godzin; powiększenie 125x, kontrast fazowy.