Archivio_longshot_genoma

# README per studenti ## Analisi di varianti sul genoma completo del cane (ROS_Cfam_1.0) Questo documento spiega **in modo completo e guidato** il significato e l’uso dei file: * `*.fasta`* `*.fasta.fai`* `*.bam`* `*.bam.bai` utilizzati per il **variant calling con Longshot** sul **genoma completo del cane** (*Canis lupus familiaris*). **Leggere tutto prima di lanciare comandi**: molti errori nascono da reference e coordinate sbagliate. --- ## 1. Il file FASTA del genoma (`combined_refs.fasta`) ### Cos’è Il file `combined_refs.fasta` contiene le **sequenze di riferimento del genoma completo del cane**, una per ogni cromosoma. Esempio di intestazioni: ```text>1 dna:primary_assembly primary_assembly:ROS_Cfam_1.0:1:1:123313939:1 REF>2 dna:primary_assembly primary_assembly:ROS_Cfam_1.0:2:1:86187811:1 REF...``` ### Come leggerle Ogni riga `>` descrive: * **nome del cromosoma** (`1`, `2`, `3`, …)* **assembly**: ROS_Cfam_1.0* **coordinate**: da `1` a `LN` (lunghezza cromosoma) Questo FASTA rappresenta **l’intero genoma**, non una porzione. --- ## 2. Il file FASTA index (`combined_refs.fasta.fai`) ### Cos’è È l’**indice del FASTA**, creato con: ```bashsamtools faidx combined_refs.fasta``` ### A cosa serve * Permette accesso rapido a singole regioni del genoma* È **obbligatorio** per: * samtools * bcftools * Longshot Senza `.fai`, i comandi con `chr:start-end` non funzionano correttamente. --- ## 3. Il file BAM (`*.bam`) ### Cos’è Il file `.bam` contiene le **read di sequenziamento allineate** contro il reference FASTA. Caratteristiche importanti: * È un file binario (non leggibile a occhio)* Contiene: * cromosoma * posizione * qualità * allineamento ### Controllo fondamentale (da fare SEMPRE) Prima di ogni analisi, verificare il reference usato: ```bashsamtools view -H file.bam | grep '^@SQ' | head``` Esempio corretto: ```text@SQ SN:1 LN:123313939@SQ SN:2 LN:86187811``` I nomi (`SN`) e le lunghezze (`LN`) **devono combaciare** con il FASTA. --- ## 4. Il file BAM index (`*.bam.bai`) ### Cos’è È l’**indice del BAM**, creato con: ```bashsamtools index file.bam``` ### A cosa serve * Accesso rapido a regioni specifiche del BAM* Necessario per: * `samtools view chr:start-end` * `samtools depth` * Longshot con `--region` Se il BAM cambia, l’indice va rigenerato. --- ## 5. Coordinate genomiche: concetto chiave Nel **genoma completo**: * le coordinate partono da **1*** arrivano fino alla lunghezza del cromosoma Esempio valido: ```text1:49662496-49740525``` Queste coordinate hanno senso **solo se**: * il BAM è allineato contro **lo stesso FASTA*** i contig hanno lo stesso nome (`1`, non `CM025100.1`) --- ## 6. Verifica della copertura (passaggio OBBLIGATORIO) Prima di lanciare Longshot: ```bashsamtools depth -r 1:49662496-49740525 file.bam | head``` ### Interpretazione * **Output presente** → la regione è coperta → analisi sensata* **Nessun output** → nessuna read → Longshot non troverà varianti Questo controllo evita **minuti o ore di calcolo inutili**. --- ## 7. Uso corretto di Longshot (genoma completo) Esempio standard: ```bashlongshot \ --bam file_genoma.sorted.bam \ --ref combined_refs.fasta \ --out varianti_chr1.vcf \ --region 1:49662496-49740525``` --- ## 8. Errore molto comune (da evitare assolutamente) Usare coordinate genomiche su BAM di **adaptive sampling**Usare BAM e FASTA non coerentiNon controllare header e coverage In caso di **adaptive sampling**, le coordinate sono **locali** (es. 1–800 kb) e **NON genomiche**. --- ## 9. Regola d’oro da ricordare > **Le coordinate esistono solo rispetto al reference usato per l’allineamento.**> BAM, FASTA e indici sono un unico sistema. --- ## 10. Checklist rapida per studenti (prima di iniziare) ☑ Ho controllato il FASTA☑ Ho controllato l’header del BAM☑ I nomi dei cromosomi coincidono☑ Ho il file `.bai`☑ Ho verificato la coverage con `samtools depth` Se tutte sono ✔️ → puoi lanciare Longshot con sicurezza.