2017-2020年长春地区H1N1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别荧光定量PCR检测方法的建立数据集

H1N1亚型流感病毒是A型流感病毒家族中的重要一员，位于哺乳动物感染流感病毒亚型之首，也是引发大流行性和季节性人流感的最主要亚型。近年来从禽类，尤其是在野鸟和活禽市场中H1N1病毒的分离概率有增高的趋势，由该亚型病毒所带来的公共威胁及其造成的经济损失已远远超过其他亚型流感。目前，H1N1流感病毒已经在人、哺乳动物和禽类群体中建立了相对稳定的遗传进化谱系。因此，了解H1N1流感病毒遗传演化谱系的感染和流行情况，对于我们识别流行毒株的谱系来源，明确在各个群体中流行的优势谱系，选择与流行谱系抗原性相匹配的疫苗以及筛选疫苗种毒等方面将大有裨益。本研究对来自GenBank和GISAID数据库中分离自中国的2,037条H1N1亚型流感病毒HA基因的遗传进化分析显示，该病毒已演化出4个不同的遗传进化谱系，分别是古典猪流感病毒谱系、季节性人流感病毒谱系、禽流感病毒谱系和欧亚类禽猪流感病毒谱系。基于进化树的谱系分析结果，我们对各谱系HA基因的核苷酸序列进行了比对，并选择HA基因的相对保守区域，针对每一谱系设计了多对鉴别引物，拟建立H1N1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别荧光定量PCR检测方法。同时，构建各谱系的阳性标准质粒，作为本方法的阳性标准品。本方法的建立过程简述如下：以各谱系阳性标准质粒为模板，首先利用普通PCR方法对各谱系鉴别引物进行初步筛选，随后对反应体系和反应条件进行优化。以筛选出的各谱系鉴别引物分别进行荧光定量PCR试验，通过构建标准曲线，对各谱系鉴别引物进行再次筛选，并对普通PCR方法所优化的反应体系和反应条件进行校验。实验结果显示，当荧光定量PCR的反应体系为：FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）10μL，ddH2O 8.75μL，浓度为10μM的上/下游引物各0.5μL，5个不同拷贝数的标准品（1010copies/μL、108copies/μL、106copies/μL、104copies/μL、102copies/μL）0.25μL，至终体积20μL；反应条件为：第一阶段，95℃2min，第二阶段，95℃15s，47℃30s，进行40个循环时，利用筛选的各谱系鉴别引物所生成的熔解曲线峰型单一，无非特异性杂峰；而且以各谱系不同拷贝数的标准质粒为模板检测到的Ct值比较均匀地分布在标准曲线上，呈现出良好的线性关系（R2均≥0.945）；各谱系鉴别荧光定量PCR方法的检测限度可达102copies/μL，显示出所建立的方法敏感性较好。在此基础上，以临床分离的各亚型流感病毒作为检测对象，探究所建立方法的特异性。结果显示，本研究筛选的各谱系鉴别引物仅能与其对应谱系的H1N1亚型流感病毒模板结合，而与其他谱系H1N1亚型流感病毒或者H3N2、H9N2等亚型流感病毒的模板无交叉反应，表明所建立的方法具有较好的特异性。因此，本研究建立的H1N1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别荧光定量PCR方法具有较为理想的敏感性与特异性，可以快速鉴别H1N1亚型流感病毒的谱系归属。