Ti3C2TxMXene复合3D水凝胶促进耳蜗类器官功能性毛细胞的生成

1.Ti3C2TxMXene的合成
在HCl和LiF的混合物中蚀刻Ti3AlC2制备了多层Ti3C2。反应完成后，将溶液离心，用去离子水冲洗至pH值为6.0。然后将Ti3C2在冰浴中超声处理1小时，加入去离子水。Ti3C2TxMXene在4℃保存。

2. 小鼠内耳耳蜗细胞的分离
HBSS在4℃的冰箱中预冷。剪刀和镊子浸泡在75%的酒精中，紫外线照射30min。仔细地从P2小鼠耳蜗周围剥离基底膜，置于干净的预冷HBSS中。500 rpm洗涤5min后，加入IV型胶原酶和Ca2+， 37℃孵育5分钟消化。消化后，加入1ml预冷的DMEM/F12培养基，1000 rpm离心3min。下一步，解离的细胞用Falcon 40 μm过滤器过滤，1000 rpm离心3min。丢弃培养基后，加入适量新鲜培养基，使细胞重悬。

3.内耳类器官的培养
从基底膜分离的细胞用预冷的DMEM/F12洗涤两次，计数并在PE管中与Matrigel (R&D)和MXene-Matrigel基态混合。基底固化后，加入完整培养基(FCM)。FCM由AdDMEM/F12 (Gibco，含GlutaMax和Primocin)、10 μM HEPES、1:100 B27(减维生素A)、1:50 N2、50 ng/ml EGF (Peprotech)、50 ng/ml FGF (Peprotech)组成;3 μM CHIR99021 (Tocris);丙戊酸钠盐(VPA, sigma) 1mM, pVc (sigma) 100 μg/ml, A83-01 (Tocris) 1mM。
耳蜗的培养方法如前所述。在类器官扩张期间，每2或3天更换一次FCM。增殖10天后用分化培养基替代增殖培养基。分化培养基由AdDMEM/F12、primocin、1:100 B27(减维生素A)、1:50 N2、3 μM CHIR99021 (Tocris)、5 μM LY411575 (Abmole)组成。耳蜗器官分化过程中，每隔2 ~ 3天更换一次培养基。

4. RNA分离和qRT-PCR
使用RNeasy Mini Kit (QIAGEN)从耳蜗-器官中分离RNA，使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo scientific)进行反转录。采用SYBR Gree