Gebelik Sürecinde Serviks Dokusunda Meydana Gelen Değişikliklerin Raman Spektroskopisi Ile Topografik Olarak Incelenmesi

<strong>Amaç: </strong>Doğum hekimliği uygulamalarında doğumun, özellikle de kendiliğinden başlayan erken doğumun, başlamasına ait somut ve ölçülebilir veri ihtiyacı belirgindir. Mevcut durumda kullanılan klinik muayene ile bishop puanının belirlenmesi nesnel değildir. Bir diğer güncel uygulama ise transvajinal sonografi ile serviks uzunluğunun ölçülmesidir. Serviks uzunluğunun internal ostiumdan başlayarak kısalması ve hunileşmesi erken doğum lehine önemli bir bulgu olsa da yalancı pozitiflik önemli bir sorundur.

Raman spektroskopisi herhangi bir özel numune hazırlama protokolüne ihtiyaç duymadan dokuların çok hızlı biyofizikokimyasal karakterizasyonu sağlayan, lazer tabanlı, tahribatsız bir analitik karakterizasyon yöntemidir. Bir Raman spektrumu, moleküllerin lazer ile etkileşimi sonucu farklı titreşim modları oluşturulan spektral olarak dar pikler (tepeler) oluşur ve incelenen numunenin biyokimya ve yapı ile ilgili spesifik moleküler karakterizasyonunu sağlar. Lipidler, proteinler, sakkaritler, nükleik asitler ve suya karşılık gelen farklı frekanslardaki Raman sinyalleri, dokunun biyokimyasal yapısı hakkında doğrudan bilgi sunar ve sinyal yoğunluğu, molekül konsantrasyonu ile doğrusal olarak ilişkilidir.

Bugüne kadar doğum zamanı ve Raman spektroskopisi üzerine yapılan çalışmalarda gebelik ilerledikçe hücre dışı bağ dokusundaki proteinlere ve karotenoidlere ait Raman piklerinde (1248-1254 cm^-1) belirgin azalma, kana ait Raman piklerinde (1233-1563 cm^-1) belirgin artma saptanmıştır. Bu çalışmalardaki ölçümler eksternal ostium seviyesinden yapılmıştır. Oysa doğum öncesi serviks açılması internal ostium seviyesinden başlar.

Bu çalışmanın amacı serviksin internal ve eksternal ostiumunu farklı yerlerinden Raman spektroskopisi ile inceleyerek, doğumla ilişkili değişikliklerin internal ostium seviyesinde daha erken aşamada saptanıp saptanamayacağını araştırmaktır.

<strong>Gereç ve Yöntemler: </strong>Deneysel hayvan modelinde gebeliğin 15., 17., 18., 19. ve 20. günlerinde serviks dokusu çıkarılıp <em>ex vivo</em> olarak, 785 nm diod lazerden elde edilecek enerji ile incelenecektir. Serviksin vajinaya bakan yüzü (eksternal ostium) üzerindeki 3 noktadan (A1, B1 ve C1) ardışık olarak ölçüm yapıldı. Bu noktaların uterusa bakan yüzdeki (internal ostium) izdüşümlerinden (A2, B2 ve C2) de ölçüm alındı. Dokunun kurumasını ve sertleşmesini önlemek için 5 dakika fosfat tamponlu solüsyonda (PBS) bekletildi. Ardından dokunun üzerindeki fazla sıvı kurutma kağıdı ile uzaklaştırılıp, serviks kanalı boyunca uzunlamasına kesilip serviks lümeni açığa çıkarıldı. Böylece bir silindir şeklindeki serviks dikdörtgene dönüştürüldü. Dikdörtgen yüzeyinin eksternal ostium tarafından oluşturulan uzun kenarına yakın kısmında A1 ile A2 arasında A3, B1 ile B2 arasında B3, C1 ile C2 arasında C3 noktaları belirlenip, ölçüm alındı. Benzer şekilde internal ostium tarafından oluşturulan uzun kenarına yakın kısmında A1 ile A2 arasında A4, B1 ile B2 arasında B4, C1 ile C2 arasında C4 noktaları belirlenip, ölçüm alındı. 

<strong>Bulgular: </strong>Hidroksiprolin/prolin oranı açısından gebeliğin 20. gününde, ölçüm yapılan diğer günlere göre oranla, anlamlı artış vardır. Ektoserviksin endoserviks ile karşılaştırılmasında ise endoserviksteki değişimin daha da belirgin olduğu izlenmektedir. Kolajen üçlü sarmal yapısının değişiminin I₁₆₇₀/I₁₆₄₀ cm^-1’de incelenmesinde yine gebeliğin 20. gününde, ölçüm yapılan diğer günlere göre oranla anlamlı farklılık izlenmiştir. Bu parametre açısından endoserviks ve ektoserviks arasında fark izlenmemiştir. Kolajen çapraz bağ değişiminin incelendiği I₁₆₇₀/I₁₆₄₀ cm^-1’de ise 19. günde endoserviks ve ektoserviks arasında fark izlenmiştir. Toplam organik matriks içindeki yapısı değişmiş kolajen miktarı I₁₂₄₅/I₁₄₅₃ cm^-1’de ve I₁₂₄₅/CH₂ cm^-1’de eğri altında kalan alan olarak incelendiğinde 20. günde hem toplamda, hem de endoserviks ve ektoserviks arasında fark görülmüştür. Bağ dokusunu oluşturan bir diğer eleman olan proteoglikanın kolajen ile karşılaştırılması I₁₀₆₀/Amide I cm^-1’de karşılaştırılmıştır. Bu parametre için de 20. günde hem toplamda, hem de endoserviks ve ektoserviks arasında fark görülmüştür. Proteoglikanın oransal değişimini incelemek için kolajen veya toplam organik matriks başına düşen proteoglikan miktarı değişimi I₁₀₆₀/Amide I cm^-1’de, I₁₀₈₉/Amide III cm^-1’de, I₁₃₆₅/Amide III cm^-1’de eğri altında kalan alan ve intensite olarak değerlendirilmiştir. Yine bu parametre için de 20. günde, ölçüm yapılan diğer günlere göre oranla, hem toplamda, hem de endoserviks ve ektoserviks arasında fark görülmüştür. Ancak I₁₃₇₅/Amide I cm^-1’de kolajen başına düşen proteoglikan miktarı değişimi alan üzerinden değerlendirildiğinde ölçüm yapılan günler arasında fark belirlenememiştir. Kolajen başına düşen proteoglikan miktarı değişiminin en belirgin değişimi ise I₁₃₇₅/Amide III cm^-1’de saptanmıştır. Sıçanların gebeliğinin 18., 19. ve 20. günlerinde endoserviks ve ektoserviks arasında anlamlı fark görülmüştür.

Doğumun gerçekleşmesinde, serviksin olgunlaşmasında önemli bir molekül olan prostaglandin sentezinin hammaddesi olan lipidler de lipid/amide III cm^-1’de incelenmiştir. Bu parametre kolajen başına düşen lipid miktarı değişimi ile ilişkilidir. Bulgular 18. günden itibaren endoserviks ve ektoserviks arasındaki farka işaret etmektedir. I₉₃₈/CH₂ cm^-1’de kolajen yapısal değişimi veya indirekt hidrasyonu ölçülmektedir. Bu parametrede de 18. günden itibaren endoserviks ve ektoserviks arasında belirgin fark dikkat çekmektedir.

Bağ dokusunun parçalanmasında görev alan temel enzimlerden biri olan matriks metalloproteaz (MMP) (I₁₅₈₄) ve kolajen üçlü sarmalının sağlamlaşmasını sağlayan enzim olan lizil oksidaz (LOX)’a ait olabilecek benzer bir belirteç tanımlanmıştır (I₁₅₉₈). Bu bölgenin Amide I’e oranı özellikle gebeliğin son gününde belirgin değişikliklere işaret etmektedir.

Serviks bağ dokusunun parçalanmasını sağlayan MMP’nin aktivitesinin ve miktarının artmasını sağlayan immun yanıtın başlangıcı makrofaj hücre artışıdır. Makrofaj hücreleri için belirteç olan I₁₀₃₅/CH₂ incelendiğinde tüm parametreler içinde en erken bulgu veren ve endoserviks/ektoserviks ayrımı yapan olduğu görülmektedir. 17. günden itibaren bu parametrede belirgin farklılık ve endoserviks/ektoserviks ayrımı göze çarpmaktadır.

<strong>Sonuç: </strong>Çalışmamızda elde edilen bulgular Raman spektroskopisi ile doğum zamanını tespit etmeye çalışan diğer araştırmalardan farklı olarak serviksin uterusa yakın kısmında daha erken değişiklikler olduğuna işaret etmektedir.