Análisis in silico de la Reacción de Amplificación Isotérmica Mediada por Bucle de Transcripción Inversa (RT-LAMP) para la identificación del Virus del Dengue (Orthoflavivirus denguei) en Colombia

El repositorio contiene los apéndices y la información complementaria del trabajo de grado titulado “Análisis in silico de la Reacción de Amplificación Isotérmica Mediada por Bucle con Transcripción Inversa (RT-LAMP) para la identificación del Virus del Dengue (Orthoflavivirus denguei) en Colombia”, realizado en la Escuela de Biología de la Universidad Industrial de Santander, Colombia. Este trabajo se encuentra adscrito al proyecto “Identificación del Virus del Dengue (DENV) en muestras de pacientes mediante RT-LAMP usando horno de microondas doméstico”, financiado por la Convocatoria Interna de Investigación de la E.S.E. Hospital Universitario de Santander y la Vicerrectoría de Investigación y Extensión de la Universidad Industrial de Santander, con número de proyecto 8078. Apéndice A: Base de datos de secuencias genómicas para los cuatro serotipos del virus del dengue en países sudamericanos (Genom.Ser-Dengue-RT-LAMP.v2025/SudAmer), reportadas hasta febrero de 2025 en el repositorio del GenBank. El repositorio contiene la carpeta titulada “Obtención y selección de secuencias de Dengue”, la cual, incluye cuatro subcarpetas correspondientes a los diferentes serotipos del virus del dengue. En el interior de cada subcarpeta se encuentran archivos en formato de texto plano, cuyos títulos indican el país de origen de las secuencias genómicas del serotipo correspondiente. Todas las secuencias se presentan en formato FASTA. Apéndice B. Secuencias genómicas filtradas de la base de datos Genom.Ser-Dengue-RT-LAMP.v2025/SudAmer. Esta nueva base de datos se nombró: Genom.Ser-Dengue-RT-LAMP.v2025.SudAmer.Filtered. El repositorio contiene cuatro subcarpetas, correspondientes a los distintos serotipos del Virus del Dengue. Cada una de ellas, incluye archivos en formato de texto plano, cuyos títulos especifican el serotipo, el país seleccionado y la etiqueta “Filtrado”. Cada archivo contiene secuencias genómicas que fueron sometidas a un proceso automático de filtrado y control de calidad con el Software Dengue Filter para excluir regiones indeterminadas, gaps y nucleótidos ambiguos identificados como “N” en los registros del repositorio del GenBank. Todas las secuencias se presentan en formato FASTA. Apéndice C. Verificación mediante alineamiento múltiple de los genomas de cada serotipo del virus del dengue del repositorio Genom.Ser-Dengue-RT-LAMP.v2025.SudAmer.Filtered. El repositorio contiene cuatro subcarpetas, tituladas con cada uno de los serotipos del Virus del Dengue. En el interior de cada una de ellas, se localizan archivos en formato de texto plano, cuyo título indica: el serotipo, el país y la etiqueta “SerotypeChecked”, la cual, permite identificar aquellas secuencias resultantes de un nuevo proceso automático de verificación, filtrado y control de calidad. Dicho proceso, se realizó mediante un alineamiento múltiple con el software MAFFT, versión 7, con un gap opening penalty de 5.0 y un offset value de 1.0, lo que permitió excluir secuencias correspondientes a serotipos distintos. Es decir, aquellos serotipos asignados erroneamente en el repositorio del GenBank. Todas las secuencias se presentan en formato FASTA. Apéndice D. Secuencias alineadas del virus del dengue resultantes del proceso de filtrado, depuración y verificación por serotipo en los países de Sudamérica. El repositorio contiene once carpetas, cuyos títulos corresponden a los países sudamericanos incluidos en el análisis. Cada carpeta agrupa las secuencias resultantes del proceso de depuración y verificación de los serotipos del Virus del Dengue descrito en el Apéndice C, organizadas por país de origen. En el interior de cada carpeta, se localizan entre uno y cuatro archivos en formato de texto plano, cuyos títulos indican el serotipo, el país correspondiente y la etiqueta “Aligned”. Todos los archivos contienen secuencias genómicas en formato FASTA. Es de resaltar, que para los archivos con una sola secuencia por serotipo, solo se reporta la secuencia sin alinear. Apéndice E. Secuencias consenso de los cuatro serotipos del Virus del Dengue obtenidas a partir de los alineamientos descritos en el Apéndice D, en función del flujo poblacional para: Colombia, Venezuela y Ecuador. El repositorio contiene cuatro subcarpetas, nombradas de acuerdo con cada uno de los serotipos del Virus del Dengue. En el interior de cada una, se localizan tres archivos en formato de texto plano, cuyos títulos indican: el serotipo, el país correspondiente y la etiqueta “Consensus”. Cada archivo incluye dos secuencias consenso. En la primera, las posiciones con un nucleótido mayoritario se representan utilizando el nucleótido correspondiente. Esta secuencia se identifica mediante el símbolo mayor que (>), seguido de las tres primeras letras del país, el serotipo y el número 20% como un umbral de frecuencia, el cual, corresponde al umbral de frecuencia empleado para la obtención del consenso. En la segunda secuencia consenso, las posiciones que presentan dos o más nucleótidos distintos, se indican mediante los códigos de ambigüedad establecidos por la International Union of Pure and Applied Chemistry. Para esta secuencia, se utilizó la misma nomenclatura de identificación, sustituyendo el valor 20% por el número 100%, con el fin de resaltar el umbral de frecuencia aplicado. Ambos consensos fueron generados con el software BioEdit, versión 7.2.5, a partir de los alineamientos múltiples obtenidos previamente y descritos en el Apéndice D. Apéndice F: Posición de cebadores en las cuatro secuencias consenso de los serotipos del Virus del Dengue indicadas en el inciso E para la Reacción de Amplificación Isotérmica Mediada por Bucle de Transcripción Inversa (RT-LAMP). El repositorio contiene cinco archivos en formato PDF. Cuatro de ellos, indican el serotipo seguido de las palabras “Primer in Sequence” correspondientes a los sitios y regiones de los genomas concesos indicados en el apéndice E, donde se localizan cada uno de los cebadores para RT-LAMP. Para estos cuatro documentos, se indican los siguientes colores: en color verde, se indican las secuencias pertenecientes al cebador F3 (Forward outer primer), mientras que el color Rosado representa el cebador B3 (Backward outer primer). A su vez, los cebadores para FIP (Forward Inner primer), se representaron con el color Rojo y BIP (Backward Inner primer), con color Naranja. El documento con título: “Dengue Virus RT-LAMP Primers”, contiene cuatro tablas para los cuatro serotipos del dengue, divididas en seis columnas. A saber: (i) El segmento en el cual se encontraron los cebadores. (ii) La cantidad de sets obtenidos con el software NEB LAMP Primer Design Tool. (iii) La secuencia del Forward outer primer (5’-3’). (iv) La secuencia de Backward outer primer (5’-3’). (v) La secuencia de Forward Inner primer (5’-3’). (vi) La secuencia de Backward Inner primer (5’-3’). Apéndice G: Comparación de los cebadores frente a secuencias de referencia. El apéndice contiene un archivo en formato PDF, titulado “Comparative Analysis of RT-LAMP Primers for Dengue Virus” que presenta la validación y comparación in silico de la posible hibridación inespecífica de los cebadores diseñados para la detección del Virus del Dengue (DENV) frente a secuencias homólogas de DENV y otros arbovirus de importancia epidemiológica (Virus del Chikunguña, Virus del Zika y Virus de la Fiebre Amarilla). El documento incluye una tabla estructurada en siete columnas, organizada por serotipo, que detalla: (i) el serotipo correspondiente, (ii) el cebador evaluado, (iii) la secuencia blanco potencial de hibridación, (iv) la región genómica codificante asociada, (v) la posición relativa dentro de la secuencia analizada, (vi) el número de acceso en GenBank de la secuencia de referencia utilizada para la comparación y (vii) el nombre completo de dicha secuencia. Este análisis complementa la evaluación de especificidad del diseño, permitiendo estimar la posible reactividad cruzada a nivel in silico. ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ The repository contains the appendices and supplementary information for the undergraduate thesis entitled “In Silico Analysis of Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) for the Identification of Dengue Virus (Orthoflavivirus denguei) in Colombia,” carried out at the School of Biology of the Universidad Industrial de Santander (UIS), Colombia. This work is part of the project “Identification of Dengue Virus (DENV) in Patient Samples by RT-LAMP Using a Household Microwave Oven,” funded through the Internal Research Call of the E.S.E. Hospital Universitario de Santander and the Office of the Vice President for Research and Extension of the Universidad Industrial de Santander, under project number 8078. Appendix A: Genomic sequence database for the four dengue virus serotypes in South American countries (Genom.Ser-Dengue-RT-LAMP.v2025/SudAmer), as reported up to February 2025 in the GenBank repository. The repository includes a folder titled “Dengue Sequence Retrieval and Selection,” which contains four subfolders corresponding to the different dengue virus serotypes. Within each subfolder are plain-text files whose titles indicate the country of origin of the genomic sequences for the corresponding serotype. All sequences are provided in FASTA format. Appendix B: Filtered genomic sequences from the Genom.Ser-Dengue-RT-LAMP.v2025/SudAmer database. This new database was named Genom.Ser-Dengue-RT-LAMP.v2025.SudAmer.Filtered. The repository contains four subfolders corresponding to the different dengue virus serotypes. Each subfolder includes plain-text files whose titles specify the serotype, the selected country, and the label “Filtered.” Each file contains genomic sequences that underwent an automated filtering and quality-control process using the Dengue Filter software to exclude undetermined regions, gaps, and ambiguous nucleotides identified as “N” in GenBank records. All sequences are provided in FASTA format. Appendix C: Verification by multiple sequence alignment of the genomes for each dengue virus serotype from the Genom.Ser-Dengue-RT-LAMP.v2025.SudAmer.Filtered repository. The repository contains four subfolders named after each dengue virus serotype. Inside each folder are plain-text files whose titles indicate the serotype, the country, and the label “SerotypeChecked,” which identifies sequences resulting from a new automated verification, filtering, and quality-control process. This process was performed using a multiple sequence alignment with MAFFT software, version 7, with a gap opening penalty of 5.0 and an offset value of 1.0, which allowed the exclusion of sequences corresponding to different serotypes—i.e., those erroneously assigned serotypes in GenBank. All sequences are provided in FASTA format. Appendix D: Aligned dengue virus sequences resulting from the filtering, curation, and serotype verification process in South American countries. The repository contains eleven folders, each named after a South American country included in the analysis. Each folder groups the sequences resulting from the serotype curation and verification process described in Appendix C, organized by country of origin. Within each folder, there are between one and four plain-text files whose titles indicate the serotype, the corresponding country, and the label “Aligned.” All files contain genomic sequences in FASTA format. Notably, for files that include only a single sequence per serotype, the sequence is provided without alignment. Appendix E: Consensus sequences for the four dengue virus serotypes obtained from the alignments described in Appendix D, based on population flow for Colombia, Venezuela, and Ecuador. The repository contains four subfolders named after each dengue virus serotype. Inside each one are three plain-text files whose titles indicate the serotype, the corresponding country, and the label “Consensus.” Each file includes two consensus sequences. In the first, positions with a majority nucleotide are represented using the corresponding nucleotide. This sequence is identified by the greater-than symbol (>), followed by the first three letters of the country, the serotype, and the number 20% frequency threshold, which corresponds to the frequency threshold used to generate the consensus. In the second consensus sequence, positions showing two or more different nucleotides are indicated using the ambiguity codes established by the International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC). For this sequence, the same identification nomenclature was used, replacing 20% with 100% to highlight the frequency threshold applied. Both consensus sequences were generated with BioEdit software, version 7.2.5, from the multiple sequence alignments previously obtained and described in Appendix D. Appendix F: Primer positions in the four consensus sequences of dengue virus serotypes indicated in Appendix E for Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP). The repository contains five PDF files. Four of them indicate the serotype followed by the words “Primer in Sequence,” corresponding to the sites and regions of the consensus genomes described in Appendix E where each RT-LAMP primer is located. In these four documents, the following color scheme is used: green indicates sequences belonging to the F3 primer (forward outer primer), while pink represents the B3 primer (backward outer primer). The FIP primers (forward inner primer) are shown in red, and the BIP primers (backward inner primer) are shown in orange. The document titled “Dengue Virus RT-LAMP Primers” contains four tables—one for each dengue serotype—organized into six columns: (i) the segment in which the primers were found; (ii) the number of primer sets obtained with the NEB LAMP Primer Design Tool; (iii) the forward outer primer sequence (5'–3'); (iv) the backward outer primer sequence (5'–3'); (v) the forward inner primer sequence (5'–3'); and (vi) the backward inner primer sequence (5'–3'). Appendix G: Primer comparison against reference sequences. This appendix includes a PDF file titled “Comparative Analysis of RT-LAMP Primers for Dengue Virus,” which presents an in silico validation and comparative analysis of potential nonspecific hybridization of the primers designed for dengue virus (DENV) detection against homologous DENV sequences and other epidemiologically important arboviruses (chikungunya virus, Zika virus, and yellow fever virus). The document includes a seven-column table organized by serotype, detailing: (i) the corresponding serotype; (ii) the primer evaluated; (iii) the potential target sequence for hybridization; (iv) the associated coding genomic region; (v) the relative position within the analyzed sequence; (vi) the GenBank accession number of the reference sequence used for comparison; and (vii) the full name of that sequence. This analysis complements the specificity assessment of the primer design by enabling estimation of potential in silico cross-reactivity.