Hodowla środkowych fragmentów mieszka włosowego

Celem badania było pozyskanie keratynocytów ze środkowych fragmentów mieszków włosowych uzyskiwanych ze skóry szczura. W eksperymencie użyto mieszków włosowych, izolowanych ze skóry czterotygodniowych samic szczurów szczepu Wistar Albino Glaxo. Skórę z mieszkami włosowymi poddano działaniu roztworu kolagenazy, DNazy i TLCK Sigma Diagnostics, St. Louis, MO, USA) o stężeniach odpowiednio 2 mg/ml, 1.57 mg/ml i 7 nM w pożywce RPMI (Gibco) z dodatkiem 1 % antybiotyku/antymykotyku (Gibco). Trawienie przeprowadzano w temperaturze 37° C przez godzinę przy jednoczesnym mieszaniu na mieszadle magnetycznym. Po inkubacji mieszaninę filtrowano przez sitko metalowe o średnicy oczek 100 μm, aby pozbyć się niestrawionych fragmentów skóry. Uzyskaną w ten sposób zawiesinę fragmentów środkowych płukano trzykrotnie roztworem PBS (Wytwórnia Surowic i Szczepionek, Lublin, Polska), i zawieszano w pożywce standardowej do hodowli keratynocytów (PromoCell GmbH, Heidelberg, Niemcy) z dodatkiem: 0,4 % ekstraktu przysadki bydlęcej, 0,125 ng/ml EGF, 5 μg/ml insuliny, 0,33 μg/ml hydrokortyzonu, 10 μg/ml transferyny, 0,39 μg/ml epinefryny oraz 1% antybiotyku/antymykotyku (Gibco). Pożywka zawierała niskie stężenie jonów wapnia – 0,09 mM. Małe porcje zawiesiny nanoszono na szalki Petriego o średnicy 6 cm (Costar Corp., Cambridge MA, USA) i oczyszczano z niepożądanych fragmentów mieszków włosowych pod binokularem, pod powiększeniem 40- krotnym. Uzyskaną czystą zawiesinę fragmentów środkowych zbierano i wysiewano do butelek hodowlanych (Costar) w pożywce standardowej. Po 24 h pożywkę zmieniano w celu usunięcia fragmentów mieszków, które nie przykleiły się do plastiku, oraz drobnych fragmentów skóry i naczyń krwionośnych, pozostałych po izolacji. Izolowane fragmenty środkowe były obserwowane codziennie i fotografowane w mikroskopie świetlnym odwróconym kontrastowo fazowym. Na zdjęciach hodowle środkowych fragmentów mieszka włosowego; (a) fragment środkowy bezpośrednio po izolacji; (b), (c) i (d) różne fragmenty odpowiednio po 24, 48 i 72 godzinach od wysiania do butelki; powiększenie 125x, kontrast fazowy.