枣树ZjMT原核表达载体的构建及功能分析

枣树(Ziziphus jujuba Mill)原产于我国黄河流域，是我国特有的经济林树种之一.具有耐寒、抗旱、耐盐碱、抵御各种外界不良因子的能力强的特性.枣树的抗逆性基因是非常宝贵的遗传资源，为了挖掘和研究枣树有关抗逆应答基因，本研究以壶瓶枣为试材，从其结果枝cDNA文库中克隆获得了金属硫蛋白基因，命名为ZjMT(Ziziphus jujuba Metallothionein，ZjMT).利用生物信息学软件对其序列进行了分析;采用基因重组技术，构建了原核表达载体，并进行了功能分析.结果表明: 1、ZjMT的碱基序列在Genbank中的登录序号是AB513130，命名为ZjMT(Ziziphus jujuba Metallothionein，ZjMT).该基因的cDNA全长225bp，编码74个氨基酸，两端是高度保守的半胱氨酸富含区，中间是不含半胱氨酸的间隔区，呈典型的三段式结构，属于MT-1型金属硫蛋白. 2、根据ZjMT的碱基序列设计特异性PCR引物，以克隆载体pSPORT1携带的ZjMT cDNA为模板，PCR扩增出全长cDNA，将其重组入原核表达载体pGEX-4T-2中，构建了ZjMT原核表达载体pGEX-ZjMT.将该重组质粒转入E.coli BL21中构建了基因工程菌pGEX-ZjMT-B. 3、pGEX-ZjMT-B体外表达研究证明，经1mM的IPTG诱导4h后，35 kDa处成功表达了目的融合蛋白GST-ZjMT.对不同的诱导时间和IPTG诱导浓度等条件的优化实验结果表明，随诱导时间增长GST-ZjMT融合蛋白表达量提高，4小时时达到最大，后随时间增加融合蛋白的表达量无明显变化;IPTG浓度在0.1mM时就可以产生有效诱导GST-ZjMT融合蛋白的表达，且随着IPTG浓度的增加融合蛋白的表达量亦无明显变化.在0.1mM的IPTG下诱导4小时大量表达融合蛋白后提取总蛋白，用GST亲和介质Glutathione Resins树脂进行目的蛋白纯化，洗脱后的蛋白质样品进行SDS-PAGE电泳检测，在35 kDa处有明显条带，表明已获得目的蛋白GST-ZjMT. 4、基因工程菌pGEX-ZjMT-B对六种重金属离子Cd2+、Cr3+、Mn2+、Zn2+、Ni2+、Cu2+的耐受性实验结果表明:工程菌耐受最高离子浓度依次为Mn2+ 10000μM > Cu2+ 4000μM > Ni2+ 3500μM > Cr3+ 2000μM > Zn2+ 1000μM > Cd2+ 900μM. 依据工程菌在不同浓度金属离子下的生长势我们将其对重金属的耐受性分为:受影响较小基本正常生长;长势受到影响但还能增殖，曲线还呈上升状态;长势受到抑制，图中表现为平缓曲线;每种金属选择以上三个浓度进行螯合量的测定.结果表明与对照菌相比，工程菌螯合重金属量都有明显增加，但对各种重金属的螯合效果不尽相同: 每克干工程菌菌体对六种重金属的最大螯合量大小依次为:Cu2+ 3075μg > Cr3+ 1145.2μg > Mn2+ 734.7μg > Cd2+ 696μg > Zn2+ 354.3μg > Ni2+ 323μg; 每克干工程菌菌体对六种重金属的最大绝对螯合量依次为:Cr3+ 818μg > Cu2+ 730.5μg > Mn2+ 536.3μg > Cd2+ 291.3μg > Ni2+ 188.9μg > Zn2+ 72.7μg; 与对照菌相比从螯合量增加最大倍数来看:Zn2+ 7.99 > Mn2+ 3.7 > Cr3+ 3.5 > Ni2+ 2.95 > Cd2+ 2.32 > Cu2+1.34; 其中锌、镉在低浓度中工程菌螯合量明显大于对照菌;锰、镍、铜在中等浓度时工程菌螯合量明显大于对照菌;铬在高浓度时工程菌对其螯合量明显大于对照菌. 本研究结果为进一步了解植物金属硫蛋白的表达调控机理、结构和功能具有重要的科学参考价值，对开发植物金属硫蛋白产品提供重要的科学研究依据.