多通道生物3D打印仿生骨形貌电镜数据

采集方案：采用紫外照射法对生物墨水进行预处理，在生物打印前采用高压灭菌对打印管和针头进行预处理。3D打印系统位于通风良好的工作台中，在生物打印之前进行75%酒精和紫外线（UV）消毒。复合支架在层流柜中使用双通道独立针头进行3D生物打印。一个通道加载了内径为0.3mm的支撑打印材料[PCL（KGN）和PCL（β-TCP）]，另一个通道加载了用于生物打印的载有BMSC的水凝胶（内径为0.25mm的MeHA）。绞线距离设置为0.5mm。复合支架设计模式设置为3层，分3个步骤进行生物打印。第一步是使用PCL（β-TCP）打印底层。其次，使用载有BMSC的MeHA水凝胶和PCL（KGN）交替打印中间层。最后，使用MMP-MeHA（DC）水凝胶包覆复合支架的顶部。复合支架尺寸设置为直径为2mm、厚度为3mm的圆柱体。具体而言，PCL（β-TCP）打印层高度设置为1mm（4层），负载PCL（KGN）-BMSC的MeHA打印层高度设置为1.5mm（6层），MMP-MeHA（DC）水凝胶层设置厚度为0.5mm。然后，在UV模室中以1800mJ/cm的速率对支架进行光聚合2（10分钟，3mW/cm2）以确保交联。随后在α-MEM细胞扩增培养基中培养载有细胞的支架。采用扫描电子显微镜（SEM）观察生物打印的仿生多相骨支架的微观形，扫描仿生多相支架的跨轴视图、PCL（β-TCP）框架和MeHA水凝胶微观结构的SEM图像。
依据GB/T16886.5-2017《医疗器械生物学评价-第5部分：体外细胞毒性试验》。将L-929细胞培养在含10%胎牛血清和抗生素（青霉素100IU/mL，链霉素100μg/mL）的MEM培养液中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养。用0.25%胰酶（含EDTA）消化细胞制备成单细胞悬液，细胞悬液离心（1000rpm，5min），然后将细胞重新分散于培养基中，调整细胞密度为1×105个/mL的细胞悬液；接种上述细胞悬液到1个96孔培养板中，每孔100μL，置于培养箱中（5%CO2，37℃）培养24h，至形成半汇合单层，吸出原来的培养液，分别加入100μL不同浓度的试验样品浸提液、空白对照液、阳性对照（100%）和阴性对照液（100%），37℃、5%CO2培养24h。每组做6个平行；浸提液与细胞接触培养24h后，显微镜下观察细胞形态。相对空白对照组，阳性对照组细胞形态异常无光泽；阴性对照组细胞形态完整，贴壁紧密；样品组细胞不超过20%的细胞呈圆缩、疏松贴壁、无胞浆内颗粒或显示形态学方面的变化，偶见细胞溶解，仅观察到轻微的细胞生长抑制现象，无明显细胞毒性反应。弃去培养板孔中的培养液，每孔中加入50µL质量浓度为1mg/mLMTT培养基溶液。继续培养2h后，弃去孔内MTT培养基溶液，每孔分别加入l00µL异丙醇，平置于振荡器上振荡10min,使孔内溶液颜色均匀，在酶标仪570nm波长下测定吸光度OD值，计算细胞存活率。
依据GB/T16886.4-2022《医疗器械生物学评价-第4部分：与血液相互作用试验选择》。采用直接接触法进行试验。试验组、空白对照组、阴性对照组和阳性对照组的无菌离心管每组准备3只。取浓度在10mg/mL土1mg/mL范围内的稀释血1mL，分别加入上述准备好的无菌离心管中，混合均匀，盖好盖子后，放入37°C恒温培养振荡器中3h,期间每隔30min颠倒翻转一下离心管以保证材料与红细胞充分接触。将离心管从37°C恒温培养振荡器中取出，于800g条件下离心15min。小心吸取各管离心后的上清液1mL，分别加入1mLHiCN试剂混匀，放置5min，以HiCN试剂为空白，测定吸光度值。酶标仪(Tecan;InfiniteF200Pro)检测540nm波长处吸光度。设备情况：扫描电子显微镜(FEICompany;NOVANANOSEM450)；酶标仪(Tecan;InfiniteF200Pro)。数据大小：50MB。