Метапротеом таёжного клеща Ixodes persulcatus

<i>Образцы клещей Ixodes persulcatus</i> Образцы таежных клещей вида <i>Ixodes persulcatus,</i> далее в статье указываем аббревиатурой ТК,<i> </i>собраны в районе биологической станции Тюменского университета на озере Кучаково  в весенний период 2024 года (апрель-май). Для сбора клещей на часто посещаемых природных тропах использовался белый флаг (плотная белая материя, прикрепленная к палке) площадью 1 м². Присосавшихся  к флагу клещей выбирали пинцетом и по отдельности переносили в пробирки Eppendorf объемом 1,5 мл, содержащие 1 мл метанола концентрацией 95% и хранили при -80⁰С. После определения видовой принадлежности по морфологическим критериям для последующего этапа пробоподготовки было отобрано три самца и три самки, голодные особи. Перед началом работ клещи были взвешены: вес трёх самцов (15 мг) практически не отличался от веса самок (13 мг).<br><i>Подготовка образцов для протеомного профилирования</i>Использовали два пулированных образца: в образце 1 объединили три экземпляра самцов, а в образце 2 –  три экземпляра самок таежного клеща. Для извлечения белков из цельных насекомых тела клещей, замороженные при -80⁰С, растирали фарфоровым пестиком в фарфоровой ступке с последующим озвучиванием и солюбилизацией белков буфером на основе 2% додецилсульфата натрия (SDS).Солюбилизацию проводили в два этапа. Сначала объем добавляемой порции составлял 1:13 (вес образца клещей, мг:объём буфера, мкл). На втором этапе после озвучивания, инкубации при разных температурах и центрифугирования добавлялся такой объём буфера, чтобы конечное соотношение равнялось 1:20. С целью снизить ингибирующую активность SDS на трипсин в результирующем экстракте белков, а также эффект подавления ионизации при масс-спектрометрическом анализе детергента удаляли с помощью процедуры 1DE-гель концентрирования (SDS-PAGE без фракционирования в разделяющем геле). Перед нанесением образцов для стандартизации и сравнения получаемых результатов, был определено содержание общего белка.Концентрация белка в экстракте образца 1 (самцы) составила 3,75 мг/мл мг/мл; в экстракте образца 2 (самки) – 6,70 мг/мл. На каждую дорожку геля наносили по 75 мкг белка. Для трипсинолиза в геле вырезались срезы с бóльшим содержанием белка (по интенсивности окрашивания).Количество белка в вырезанных полосах геля в срезе геля для образца 1 и образца 2 исходя из интенсивности стандарта бычьего сывороточного альбумина составило примерно 50 мкг. Из каждого геля, т.е. для самок и самцов, вырезали по три наиболее интенсивные полосы. Гидролиз в геле проводили по стандартной методике. К срезу геля добавляли раствор, содержащий 1,25 мкг трипсина или 0,5 мкг трипсина, таким образом, было две серии экспериментов с разной концентрацией трипсина. Полученную смесь триптических пептидов использовали для масс-спектрометрического анализа. Для каждой из трех вырезанных из гелей полос масс-спектры снимали в трех технических повторах, таким образом, каждый из двух образцов (самцы и самки) соответствовал девяти пробам.  <i>Масс-спектрометрия</i>Из каждый пробы один микрограмм пептидов в объеме 1 мкл наносили на предколонку Acclaim µPrecolumn (0,5 мм × 3 мм, размер частиц 5 мкм, Thermo Scientific), скорость потока была 10 мкл/мин в течение 4 мин в изократическом режиме, подвижная фаза C (2% ацетонитрил, 0,1% муравьиная кислота). Пептиды разделяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ, Ultimate 3000 Nano LC System, Thermo Scientific) на колонке C18 длиной 15 см, внутренний диаметр 75 мкм (Acclaim PepMap RSLC, Thermo Fisher Scientific). Далее пептиды элюировали градиентом буфера Б (80 % ацетонитрила, 0,1 % муравьиной кислоты) со скоростью потока 0,3 мкл/мин. Общее время работы составило 90 минут: первые 4 минуты — уравновешивание колонки буфером А (0,1% муравьиной кислоты), а затем градиент от 5 до 35% буфера В в течение 65 минут и 6 минут до достижения 99% буфера Б. Затем колонку промывали в течение 10 минут 99% буфером Б и уравновешивали в буфере A в течение 5 минут. МС-анализ проводили с помощью масс-спектрометра Q Exactive HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap (Thermo Fisher Scientific). Температура капилляра 240°С, напряжение на эмиттере 2,1 кВ. Масс-спектры получали с разрешением 120000 (мс) в диапазоне 300–1500 m/z. Тандемные масс-спектры фрагментов получали с разрешением 15000 (МС/МС) в диапазоне от 100 m/z до значения m/z, определяемого зарядовым состоянием прекурсора, но не более 2000 m/z. Максимальное время интегрирования составляло 50 мс и 110 мс для ионов-предшественников и фрагментов, соответственно. Значение автоматической регулировки усиления  AGС для ионов-предшественников и фрагментных ионов было установлено на 1106 и 2105, соответственно. Для отбора ионов предшественников был определен порог интенсивности изоляции в 50000 отсчетов, и до 20 лучших предшественников отбирали для фрагментации с помощью высокоэнергетической столкновительной диссоциации (HCD) при уровне энергии неупругого столкновительного рассеяния NCE=29. Ионы прекурсоры с зарядом +1 и более +5 исключали из режима фрагментации, также измеренные прекурсоры динамически исключали для повторного МС/МС на период 20 с. <i>Идентификация белков </i>Для идентификации белков метапротеома из базы данных UniProtKB были отобраны последовательности аминокислотных остатков классов микроорганизмов, представители которых наиболее характерны для микробиомных сообществ иксодовых клещей. Загружая последовательности со статусом “reviewed” были сформированы четыре базы данных для классов <i>Alphaproteobacteria</i>, <i>Gammaproteobacteria,  Bacilli </i>и <i>Ascomycota  </i>содержали по 36, 125, 56 и 35 тысяч верифицированных белок-кодирующих генов, соответственно.<i> </i>В связи с небольшим количество белковых записей в общую базу данных <i>ArchActBactSpir </i>объединили последовательности представителей классов  <i>Archaea, Actinobacteria,  Bacteroidia </i> и <i>Spirochaeta</i>;<i>  </i>всего в объединенном FASTA-файле было 24420 записей. Масс-спектры в формате “raw” конвертировали в формат “MGF” с помощью программы ProteoWizard MSConvert. Поиск пептидов и белков осуществляли на базе платформы IdentiPROT (v. 3.2) с использованием поискового алгоритма IdentiPy. Основные параметры идентификации: расщепляющий фермент – трипсин; точность совпадения теоретической и экспериментальной массы пептида ±5 ppm; точность совпадения теоретической и экспериментальной массы фрагментарных ионов ±0,01 Да; значение зарядового состояния ионов пептида – “2+, 3+ и 4+”; количество возможных пропущенных участков расщепления трипсином – 1; фиксированная модификация – карбамидометилирование цистеина, окисленный метионин в качестве вариабельной модификации. Поиск проводили по базе данных инвертированных и рандомных последовательностей аминокислот (decoy), процент ложноположительных результатов (false discovery rate, FDR) = 1%. Полуколичественная оценка содержания белков выражалась нормализованным коэффициентом спектрального содержания (normalized spectral abundance factor, NSAF). Идентификацию белков<b> </b>проводили<b> </b>по MGF файлам отдельно для образца 1 (самцы) и образца 2 (самки), а также отдельно при двух разных концентрациях добавляемого в образцы трипсина.