甲型H1N1(2009)变异株以及猪流感病毒双重荧光RT-PCR检测方法

本研究利用2对引物和2条不同荧光素双标记LNA短探针（FAM，HEX）分别建立了检测甲型H1N1流感病毒2009变异株（针对M基因）和猪流感病毒（根据NP基因）的单重荧光RT-PCR快速检测方法。进一步经正交试验和方法优化，建立了检测甲型H1N1流感病毒2009变异株和猪流感病毒的双重荧光RT-PCR检测方法。建立的双重检测方法可以一步确定病原是否为甲型H1N1流感病毒变异株，以及从分子水平确定该病毒是否为经典的猪源流感病毒。对各种亚型的流感病毒以及其他动物病毒核酸进行的特异性试验结果显示，针对甲型H1N1流感病毒2009变异株M基因检测通道（FAM通道）的检测结果显示建立的方法只能检出甲型H1N1流感病毒2009变异株，不能检出其他流感病毒和其他动物病毒，表明建立的方法特异性良好；针对NP基因检测通道（HEX通道）的检测结果显示不仅甲型H1N1流感病毒2009变异株为阳性，而且对于3猪分离自猪的灭活流感病毒[A/Swine/2003(H1N1)，A/Swine/2003/GD(H3)和A/Swine/2003/2(H3)]，检测结果显示A/Swine/2003(H1N1)为阳性，A/Swine/2003/GD(H3)和A/Swine/2003/2(H3)为阴性。对这3株病毒的NP基因进行序列分析和进化分析，结果显示A/Swine/2003(H1N1)NP基因具有明显猪源特征，与经典猪流感病毒属于同一分支；而A/Swine/2003/GD(H3)和A/Swine/2003/2(H3)的NP基因与人源序列非常接近，属于同一分支，提示这2株病毒的NP基因可能是来自人的流感病毒。对于已知拷贝数的模拟RNA进行检测，结果表明应用建立的双重方法检测极限为100拷贝。采用优化的方法分别对105～107拷贝数RNA模板进行连续3次分别进行重复性试验，结果显示各组Ct变异系数均<5%，表明方法的可重复性和稳定性良好。通过采用建立的方法对592份已知样品进行验证检测，结果显示建立的方法可检出其中所有的甲型H1N1流感病毒（2009）核酸样品，此外还从非甲流变异株的H1和H3亚型流感病毒阳性样品中检出2株猪流感NP基因阳性样品。表明建立的方法可靠实用。