c-fos Immunohistochemistry Protocol

<b>Introduction</b>Many studies on memory and learning utilize the immediate early gene c-Fos as an indicator of recent synaptic activity. By quantifying c-Fos positive neurons, we can compare activity across different populations in the brain, and analyze co-labelled neurons with other useful cell markers such as BrdU and Doublecortin.Our lab recently devised an amplification protocol for c-Fos stains that specifically increases the intensity of the signal via a Biotin-Streptavidin-Rhodamine complex (see below). We have demonstrated this amplification protocol is effective over a wide range of primary antibody dilutions, with strong signaling from 1:250 to 1:5000 dilution. Basically, our amplification protocol is a fluorescent dream come true. But don’t just take our word for it, check it out for yourself. Dilutions and amplification conditions are stated in the image filenames.<b>Protocol</b>Day 1:<br>1) 3 x 5 min wash in PBS<br>2) 30 min wash 10% PBS-Triton X (TX) with 3% horse serum<br>3) Add primary antibody for 3-day incubation period (tested range of 1:250 to 1:5000 dilution of c-Fos antibody (Santa Cruz, sc-52-G) in 10% PBS-TX w/ 3% horse serum)Day 2:<br>1) 3 x 5 min wash in PBS-TX<br>2) 1 hour at room temp Secondary Antibody (biotinylated anti-goat 1:250, Jackson Immuno #705-065-147, in 10% PBS-TX w/ 3% horse serum)<br>3) 3 x 5 min wash in PBS<br>4) 30 min Blocking Solution at 5%<br>a) To make blocking solution:<br>- 40 mL PBS<br>- 0.2g blocking powder (Perkin Elmer, FP1020)<br>- Warm to dissolve then cool to room temp before use<br>5) 1:100 Streptavidin Horseradish Peroxidase (Perkin Elmer, NEL750) in Blocking Solution for 1 hour<br>6) 3 x 5 min wash in PBS<br>7) 30 min 1:2000 NHS-Rhodamine (Fisher, PI-46406), in PBS w/ 1:20,000 H2O2<br>8) 2 x 5 min wash in PBS<br>9) 1 x 5 min incubation 1:1000 DAPI in PBS<br>10) 4 x 5 min wash in PBSStaining Recommendation: Incubate any additional primary antibodies separately from amplification Day 2 after adding the Rhodamine (step 7) and completing 3 subsequent PBS washes.

**引言**
诸多记忆与学习领域的研究均以即刻早期基因c-Fos（immediate early gene c-Fos）作为近期突触活动的标志物。通过计数c-Fos阳性神经元，我们可比较大脑不同神经元集群的活动水平，并结合溴脱氧尿苷（BrdU）、双皮质素（Doublecortin）等其他实用细胞标志物分析共标记神经元。

本实验室近期开发了一种针对c-Fos染色的扩增方案，可通过生物素-链霉亲和素-罗丹明复合物（Biotin-Streptavidin-Rhodamine complex）特异性提升信号强度（详见下文）。我们已验证该扩增方案在宽范围一抗（primary antibody）稀释比例下均有效，在1:250至1:5000的稀释比例下均可获得较强的信号。简言之，本扩增方案堪称荧光染色领域的理想之选，但请勿轻信我们的单方说辞，欢迎自行验证。具体稀释比例与扩增条件详见图像文件名。

**实验方案**

第一天：
1） 用磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline, PBS）洗涤3次，每次5分钟
2） 用含3%马血清的10% PBS-Triton X（TX）溶液洗涤30分钟
3） 加入一抗（primary antibody）孵育3天（本方案已验证，c-Fos抗体（Santa Cruz公司，货号sc-52-G）在含3%马血清的10% PBS-TX溶液中的稀释比例范围为1:250至1:5000）

第二天：
1） 用PBS-TX溶液洗涤3次，每次5分钟
2） 室温下孵育二抗（secondary antibody）1小时（使用含3%马血清的10% PBS-TX溶液将生物素化抗山羊抗体稀释至1:250，Jackson Immuno公司，货号#705-065-147）
3） 用PBS洗涤3次，每次5分钟
4） 用5%封闭液封闭30分钟
a） 封闭液配制方法：
- 取40 mL PBS
- 加入0.2g封闭剂粉末（Perkin Elmer公司，货号FP1020）
- 加热溶解后冷却至室温备用
5） 将链霉亲和素-辣根过氧化物酶（Streptavidin Horseradish Peroxidase）以1:100的比例稀释于封闭液中，孵育1小时（Perkin Elmer公司，货号NEL750）
6） 用PBS洗涤3次，每次5分钟
7） 用含1:20000过氧化氢的PBS溶液将N-羟基琥珀酰亚胺-罗丹明（NHS-Rhodamine）稀释至1:2000，孵育30分钟（Fisher公司，货号PI-46406）
8） 用PBS洗涤2次，每次5分钟
9） 用含1:1000 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的PBS溶液孵育5分钟
10） 用PBS洗涤4次，每次5分钟

染色建议：在完成第7步加入罗丹明试剂及后续3次PBS洗涤后，可单独孵育其他一抗，避免与扩增步骤产生干扰。