从人内胚层干细胞大规模培养功能性和可移植的肝细胞和胆管细胞

本研究建立了基于spinner flask的无血清悬浮扩增及分化体系，利用hEnSCs在肝向诱导条件下自发形成单层封闭囊状结构——“肝球”（hepatic spheres）的特性，促进利于肝向分化的细胞极性环境的形成，使体外规模化制备高纯度的肝母细胞、肝实质细胞（E-heps）及胆管上皮细胞（E-chos）成为可能。从3x108 hEnSCs出发，利用300 mL的培养体系在30天内即可获得～2x10^9 E-heps和~6x10^8的E-chos，纯度达到95%以上。该体系在效率、靶细胞纯度等方面显著优于已报道的规模分化体系，为临床及体外应用提供了技术保证。研究者还利用单细胞转录组测序技术深入解析了该体系各关键分化步骤的细胞群体；并将E-肝脏疾病在全球范围均具有较高的发病率及死亡率。迄今为止，针对包括肝衰竭、肝豆状核变性、肝囊性纤维化、Alagille 综合征以及肝癌等终末期肝病的治疗手段极为有限。作为终末期肝病目前最有效的疗法，肝脏移植的应用和推广受到供体匮乏的严重制约，因此利用干细胞来源的肝脏主要细胞类型在体外再造肝脏组织器官成为解决这一瓶颈问题的可行方案。体外再造肝组织需要大量的各种类型的肝脏细胞，其中最重要的有肝实质和胆管上皮细胞及其共同的前体细胞——肝母细胞。因此，为了满足日益增长的药物研发及未来细胞/组织治疗的需求，建立规模化获取功能性的、可供移植的肝脏细胞的技术体系成为当务之急。本课题建立了以人内胚层干细胞（human endoderm stem cells, hEnSCs）为种子的无血清、规模化、悬浮分化系统，用于规模化生产高纯度的肝母细胞和功能性肝实质（hEnSC 来源的肝实质细胞，E-heps）及胆管上皮细胞（hEnSC 来源的胆管上皮细胞，E-chos）。我们首先评估了 hEnSCs 作为规模化制备系统的种子细胞的可行性和优势，hEnSC 具有出色的增殖能力和分化能力，并能够完成规模化三维悬浮扩增。随后，我们通过摸索不同分化系统并研究 hEnSC 体外定向分化各特定阶段的信号网络调控，建立并优化了基于 Spinner Flask 生物反应器的规模化肝向分化系统。其中，NOTCH，TGF-β 和 EGF 通路的抑制能够促进肝实质细胞的成熟；MAPK 通路的激活能够促胆管上皮细胞的成熟。我们利用综合分析手段从基因表达谱、蛋白表达、细胞纯度、及体内