Acesso à quimiodiversidade e atividades biológicas dos fungos Fusarium guttiforme e Fusarium proliferatum utilizando cocultivo

O cocultivo de fungos é uma técnica utilizada para induzir e expandir a quimiodiversidade dos microrganismos devido à ativação de vias biossintéticas que levam a novos produtos naturais não produzidos em linhagens axênicas. Desta forma, este trabalho investigou os fungos Fusarium guttiforme (F1) e Fusarium proliferatum (F7), ambos invasores do abacaxi, através do seu cultivo em meio de arroz e ISP2M1 e cocultivo. Foram realizados cultivos axênicos e cocultivo desses fungos e os extratos foram fracionados por técnicas cromatográficas e analisados ​​por RMN de ¹H. Foram conduzidos ensaios biológicos para avaliar a atividade antifúngica, antiprotozoária e inibidora de papaína. O ensaio antifúngico por diluição em ágar revelou uma atividade da fração de F7 contra F1 em 62%. Os extratos de cultura axênica de F7 e F1 revelaram atividades antifúngicas de 38% e 11% de inibição contra Colletotrichum horii, respectivamente, ao passo que o cocultivo de F7 e F1 aumentou a atividade antifúngica em até 86%. No ensaio antifúngico por diluição em caldo, algumas frações inibiram o crescimento de leveduras do gênero Candida sp. Os extratos brutos axênicos e do cocultivo do meio de arroz e ISP2M1 foram testados frente à inibição de papaína (100 µg/mL), no qual apenas os extratos do meio de arroz foram ativos, destacando-se a atividade do F7 de 87,8%. Além disso, esses extratos e as frações da CLV em meio de arroz também foram testados contra os protozoários Trypanosoma cruzi e Leishmania infatum. As frações das CLVs 4, 5 e 6, tanto do cultivo axênico de F. proliferatum (F7), como do cocultivo atingiram 100% de inibição (20 µg/mL). A abordagem metabolômica utilizou as técnicas de RMN de ¹H e LC-HRMS para analisar a quimiodiversidade induzida pelo cultivo axênico e pelo cocultivo desses fungos, revelando que os extratos de ISP2M1 particionados com n-butanol apresentaram maiores concentrações de compostos de baixo peso molecular, enquanto os extratos de arroz mostraram predominância de compostos de maior peso molecular (entre 700 e 900 Da). O processo de desreplicação, juntamente com a MVA, possibilitou a anotação de cinco metabólitos discriminantes no meio de arroz, como subglutinol A e beauvericina, encontrados predominantemente no extrato axênico de F. proliferatum (F7), e samroiyotmicina A, mais intenso no extrato de cocultivo. O extrato fúngico obtido com AcOEt no meio ISP2M1 revelou 21 compostos, embora apenas um tenha sido de origem fúngica. Por outro lado, o extrato particionado com n-butanol revelou metabólitos anteriormente detectados em maior concentração no extrato axênico de F. guttiforme (F1), identificados como pulchellalactam, ácido desidrofusárico e ácido fusárico. A análise de RMN de ¹H mostrou que as frações de CLV apolares apresentaram predominância de lipídios, enquanto as frações de polaridade média exibiram a presença de compostos fenólicos.

真菌共培养是一种用于诱导并拓展微生物化学多样性的技术，其通过激活生物合成通路，使微生物产生单培养（axenic）菌株无法合成的新型天然产物。基于此，本研究针对两种菠萝致病菌——伤腐镰刀菌（Fusarium guttiforme，F1）与层出镰刀菌（Fusarium proliferatum，F7），分别采用大米培养基、ISP2M1培养基开展纯培养，并进行共培养实验。本研究完成了上述菌株的纯培养与共培养，随后通过色谱技术对培养提取物进行分级分离，并采用氢核磁共振（¹H-NMR）进行分析。同时开展多项生物学活性测定，以评估提取物的抗真菌、抗原生动物以及木瓜蛋白酶抑制活性。琼脂稀释法抗真菌实验结果显示，层出镰刀菌F7的分级组分对伤腐镰刀菌F1的抑制率可达62%。F7与F1的纯培养提取物对荷氏炭疽菌（Colletotrichum horii）的抑制率分别为38%与11%，而二者共培养提取物的抗真菌活性提升至86%。在肉汤稀释法抗真菌实验中，部分分级组分可抑制假丝酵母属（Candida sp.）酵母菌的生长。针对大米培养基与ISP2M1培养基的纯培养及共培养粗提取物，本研究开展了木瓜蛋白酶抑制活性测试（测试浓度为100 μg/mL），结果仅大米培养基来源的提取物表现出活性，其中层出镰刀菌F7提取物的抑制率可达87.8%，尤为突出。此外，上述提取物与大米培养基来源的色谱分级组分（CLV）还被用于测试抗克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）与莱什曼原虫（Leishmania infatum）的活性。在20 μg/mL的测试浓度下，层出镰刀菌F7纯培养与共培养体系的CLV组分4、5、6均实现了100%的抑制活性。本研究采用氢核磁共振与液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）联用的代谢组学方法，分析了上述真菌纯培养与共培养诱导产生的化学多样性，结果显示：经正丁醇萃取的ISP2M1培养基提取物中低分子量化合物浓度更高，而大米培养基提取物则以分子量在700~900 Da之间的高分子量化合物为主。通过去重复分析与多元变量分析（MVA），本研究在大米培养基提取物中注释得到5种差异代谢物：主要存在于层出镰刀菌F7纯培养提取物中的亚谷醇A（subglutinol A）与白僵菌素（beauvericina），以及在共培养提取物中含量更高的沙姆罗伊霉素A（samroiyotmicina A）。采用乙酸乙酯（AcOEt）从ISP2M1培养基中萃取得到的真菌提取物中共检出21种化合物，但其中仅1种为真菌来源。另一方面，经正丁醇萃取得到的提取物中则检出了此前在伤腐镰刀菌F1纯培养提取物中高浓度存在的代谢物，经鉴定为美丽内酰胺（pulchellalactam）、脱氢镰刀菌酸（ácido desidrofusárico）与镰刀菌酸（ácido fusárico）。氢核磁共振分析结果显示，非极性CLV组分以脂质类成分为主，而中等极性组分则含有酚类化合物。