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Manuscript Title:
Co-targeting of BTK and MALT1 overcomes resistance to BTK inhibitors in mantle cell lymphoma

Journal:
Journal of Clinical Investigation

Authors
Vivian Changying Jiang1, Yang Liu1, Junwei Lian1, Shengjian Huang1, Alexa Jordan1, Qingsong Cai1, Fangfang Yan3, Joseph Mitchell McIntosh1, Yijing Li1, Yuxuan Che1, Zhihong Chen1, Jovanny Vargas1, Maria Badillo1, JohnNelson Bigcal1, Heng-Huan Lee1, Wei Wang1, Yixin Yao1, Lei Nie1, Christopher Flowers1, and Michael Wang1, 2*

Abstract
Bruton’s tyrosine kinase (BTK) is a proven target in mantle cell lymphoma (MCL), an aggressive subtype of non-Hodgkin lymphoma. However, resistance to BTK inhibitors is a major clinical challenge. We here report that MALT1 is one of the top overexpressed genes in ibrutinib-resistant MCL cells, while expression of CARD11, which is upstream of MALT1, is decreased. MALT1 genetic knockout or inhibition produced dramatic defects in MCL cell growth regardless of ibrutinib sensitivity. Conversely, CARD11 knockout cells showed anti-tumor effects only in ibrutinib-sensitive cells, suggesting that MALT1 overexpression could drive ibrutinib resistance via bypassing BTK-CARD11 signaling. Additionally, BTK knockdown and MALT1 knockout markedly impaired MCL tumor migration and dissemination, and MALT1 pharmacological inhibition decreased MCL cell viability, adhesion, and migration by suppressing NF-κB, PI3K-ATK-mTOR, and integrin signaling. Importantly, co-targeting MALT1 with safimaltib and BTK with pirtobrutinib induced potent anti-MCL activity in ibrutinib-resistant MCL cell lines and patient-derived xenografts. Therefore, we conclude that MALT1 overexpression associates with resistance to BTK inhibitors in MCL, targeting abnormal MALT1 activity could be a promising therapeutic strategy to overcome BTK inhibitor resistance, and co-targeting of MALT1 and BTK should improve MCL treatment efficacy and durability as well as patient outcomes.

Dataset description:
The bulk RNA-seq dataset was generated for the cell lines below and used for two major purposes:
1. DEG analysis and GSEA analysis comparing IBN-R and IBN-S cells
2. DEG analysis and GSEA analysis comparing MCL cells with/without MI-2 treatment.

sample Cell MI-2 Ibrutinib (IBN) Venetoclax (VEN) Used for IBN-R vs IBN-S comparison Used for MI-2 vs untreated (DMSO)
H9 Granta519 - R S yes
H21 Granta519 - R S yes
H33 Granta519 - R S yes
H10 Granta519-VEN-R - R R yes
H22 Granta519-VEN-R - R R yes
H34 Granta519-VEN-R - R R yes
H3 JeKo BTK KD_1 - R R yes yes
H15 JeKo BTK KD_1 - R R yes yes
H27 JeKo BTK KD_1 - R R yes yes
H5 JeKo BTK KD_2 - R R yes yes
H17 JeKo BTK KD_2 - R R yes yes
H29 JeKo BTK KD_2 - R R yes yes
H1 JeKo-1 - S R yes yes
H13 JeKo-1 - S R yes yes
H25 JeKo-1 - S R yes yes
H7 Mino - S S yes
H19 Mino - S S yes
H31 Mino - S S yes
H8 Mino-VEN-R - S R yes
H20 Mino-VEN-R - S R yes
H32 Mino-VEN-R - S R yes
H11 Rec-1 - S S yes
H23 Rec-1 - S S yes
H12 Rec-VEN-R - S S yes
H24 Rec-VEN-R - S R yes
H36 Rec-VEN-R - S R yes
H35 Rec-1 -- S R yes
H4 JeKo BTK KD_1 + MI-2 + yes
H16 JeKo BTK KD_1 + MI-2 + yes
H28 JeKo BTK KD_1 + MI-2 + yes
H6 JeKo BTK KD_2 + MI-2 + yes
H18 JeKo BTK KD_2 + MI-2 + yes
H30 JeKo BTK KD_2 + MI-2 + yes
H2 JeKo-1 + MI-2 + yes
H14 JeKo-1 + MI-2 + yes
H26 JeKo-1 + MI-2 + yesEGA dataset EGAD00001009771

# 手稿标题
共靶向布鲁顿酪氨酸激酶（Bruton’s tyrosine kinase, BTK）与MALT1克服套细胞淋巴瘤对BTK抑制剂的耐药性

# 期刊
《临床研究杂志》（Journal of Clinical Investigation）

# 作者
蒋常颖（Vivian Changying Jiang）¹, 刘阳¹, 连俊伟¹, 黄圣健¹, 亚历克斯·乔丹¹, 蔡青松¹, 闫芳芳³, 约瑟夫·米切尔·麦金托什¹, 李一静¹, 车宇轩¹, 陈智宏¹, 霍万尼·巴尔加斯¹, 玛丽亚·巴列霍¹, 约翰·纳尔逊·比加尔¹, 李恒桓¹, 王威¹, 姚毅欣¹, 聂磊¹, 克里斯托弗·弗劳尔斯¹, 以及迈克尔·王¹,²*

# 摘要
布鲁顿酪氨酸激酶（Bruton’s tyrosine kinase, BTK）已被证实是套细胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma, MCL）——一种侵袭性非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma, NHL）亚型——的经典治疗靶点。然而，BTK抑制剂耐药仍是当前临床面临的核心挑战。本研究发现，MALT1是伊布替尼耐药MCL细胞中表达上调最显著的基因之一，而其上游调控基因Caspase recruitment domain-containing protein 11 (CARD11)的表达水平则显著下调。无论细胞对伊布替尼是否敏感，MALT1的基因敲除或药理学抑制均可显著抑制MCL细胞的增殖活性。与之相反，CARD11基因敲除仅在伊布替尼敏感的MCL细胞中展现出抗肿瘤效应，提示MALT1过表达可通过绕过BTK-CARD11信号通路介导伊布替尼耐药。此外，同时敲低BTK与敲除MALT1可显著损害MCL肿瘤细胞的迁移与播散能力；而MALT1的药理学抑制可通过抑制核因子κB（Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells, NF-κB）、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B-雷帕霉素靶蛋白（Phosphatidylinositol 3-kinase-Akt-mammalian target of rapamycin, PI3K-AKT-mTOR）及整合素信号通路，降低MCL细胞的存活率、黏附能力与迁移能力。值得注意的是，采用萨夫马替布（safimaltib）靶向MALT1、吡托布鲁替尼（pirtobrutinib）靶向BTK的联合治疗策略，在伊布替尼耐药MCL细胞系及患者来源异种移植瘤（patient-derived xenografts, PDX）中均展现出强效的抗MCL活性。综上，本研究证实MALT1过表达与MCL对BTK抑制剂的耐药性密切相关；靶向异常激活的MALT1活性有望成为克服BTK抑制剂耐药的潜在治疗策略；而BTK与MALT1的共靶向策略可有效提升MCL的治疗疗效、持续应答时间及患者预后水平。

# 数据集描述
本研究的批量RNA测序（bulk RNA-seq）数据集源自下述细胞系，主要用于两大分析方向：
1. 对比伊布替尼耐药（IBN-R）与伊布替尼敏感（IBN-S）MCL细胞的差异表达基因（differentially expressed genes, DEG）分析及基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）
2. 对比经MI-2处理与未处理（DMSO对照）MCL细胞的差异表达基因分析及基因集富集分析

该数据集的样本信息如下：
| 样本编号 | 细胞系 | MI-2处理状态 | 伊布替尼（IBN）响应 | 维奈克拉（Venetoclax, VEN）响应 | 用于伊布替尼耐药vs敏感组对比 | 用于MI-2处理vs未处理（DMSO）组对比 |
|----------|-----------------------|--------------|---------------------|--------------------------------|--------------------------------|-------------------------------------|
| H9 | Granta519 | 未处理 | 耐药 | 敏感 | 是 | 否 |
| H21 | Granta519 | 未处理 | 耐药 | 敏感 | 是 | 否 |
| H33 | Granta519 | 未处理 | 耐药 | 敏感 | 是 | 否 |
| H10 | Granta519-VEN-R | 未处理 | 耐药 | 耐药 | 是 | 否 |
| H22 | Granta519-VEN-R | 未处理 | 耐药 | 耐药 | 是 | 否 |
| H34 | Granta519-VEN-R | 未处理 | 耐药 | 耐药 | 是 | 否 |
| H3 | JeKo BTK KD_1 | 未处理 | 耐药 | 耐药 | 是 | 是 |
| H15 | JeKo BTK KD_1 | 未处理 | 耐药 | 耐药 | 是 | 是 |
| H27 | JeKo BTK KD_1 | 未处理 | 耐药 | 耐药 | 是 | 是 |
| H5 | JeKo BTK KD_2 | 未处理 | 耐药 | 耐药 | 是 | 是 |
| H17 | JeKo BTK KD_2 | 未处理 | 耐药 | 耐药 | 是 | 是 |
| H29 | JeKo BTK KD_2 | 未处理 | 耐药 | 耐药 | 是 | 是 |
| H1 | JeKo-1 | 未处理 | 敏感 | 耐药 | 是 | 是 |
| H13 | JeKo-1 | 未处理 | 敏感 | 耐药 | 是 | 是 |
| H25 | JeKo-1 | 未处理 | 敏感 | 耐药 | 是 | 是 |
| H7 | Mino | 未处理 | 敏感 | 敏感 | 是 | 否 |
| H19 | Mino | 未处理 | 敏感 | 敏感 | 是 | 否 |
| H31 | Mino | 未处理 | 敏感 | 敏感 | 是 | 否 |
| H8 | Mino-VEN-R | 未处理 | 敏感 | 耐药 | 是 | 否 |
| H20 | Mino-VEN-R | 未处理 | 敏感 | 耐药 | 是 | 否 |
| H32 | Mino-VEN-R | 未处理 | 敏感 | 耐药 | 是 | 否 |
| H11 | Rec-1 | 未处理 | 敏感 | 敏感 | 是 | 否 |
| H23 | Rec-1 | 未处理 | 敏感 | 敏感 | 是 | 否 |
| H12 | Rec-VEN-R | 未处理 | 敏感 | 敏感 | 是 | 否 |
| H24 | Rec-VEN-R | 未处理 | 敏感 | 耐药 | 是 | 否 |
| H36 | Rec-VEN-R | 未处理 | 敏感 | 耐药 | 是 | 否 |
| H35 | Rec-1 | 未处理 | 敏感 | 耐药 | 是 | 否 |
| H4 | JeKo BTK KD_1 + MI-2 | 处理 | 无数据 | 无数据 | 否 | 是 |
| H16 | JeKo BTK KD_1 + MI-2 | 处理 | 无数据 | 无数据 | 否 | 是 |
| H28 | JeKo BTK KD_1 + MI-2 | 处理 | 无数据 | 无数据 | 否 | 是 |
| H6 | JeKo BTK KD_2 + MI-2 | 处理 | 无数据 | 无数据 | 否 | 是 |
| H18 | JeKo BTK KD_2 + MI-2 | 处理 | 无数据 | 无数据 | 否 | 是 |
| H30 | JeKo BTK KD_2 + MI-2 | 处理 | 无数据 | 无数据 | 否 | 是 |
| H2 | JeKo-1 + MI-2 | 处理 | 无数据 | 无数据 | 否 | 是 |
| H14 | JeKo-1 + MI-2 | 处理 | 无数据 | 无数据 | 否 | 是 |
| H26 | JeKo-1 + MI-2 | 处理 | 无数据 | 无数据 | 否 | 是 |

本数据集已上传至欧洲基因组表型档案（European Genome-phenome Archive, EGA），数据集编号为EGAD00001009771。